工程院食品安全院士团队

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一、蜡样芽孢杆菌检验的卫生学意义

芽胞杆菌科，芽胞杆菌属，革兰氏阳性大杆菌。
● 在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多食品中常见
● 已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、酱油、布丁、米饭及各种甜点。
● 1950年首次在挪威明确报告其致病作用

▶ 引起食物中毒的原因－肠毒素

部分菌株能产生肠毒素，有致呕吐型和腹泻型两类。
◆ 腹泻毒素：大分子量蛋白质，引发腹泻型综合症,能在各种食物中形成；
◆ 呕吐毒素：小分子量、热稳定多肽，100℃ 30min不能被破坏，为引起呕吐型中毒的致病因素，常在米饭中形成。

临床表现：
◆ 腹泻型：潜伏期为8h～16h，主要症状为水泻、腹痛、腹痉挛为主，病程约24h。
◆ 呕吐型：潜伏期为0.5h～5h，症状以恶心、呕吐为主，病程不超过24h。  

▶ 蜡样芽胞杆菌食物中毒特征

● 以夏季（6-10月）为主

● 致病因子为细菌繁殖过程中产生的细菌毒素

● 中毒食品含菌量在10的6次方CFU/g(ml)以上

● 引起中毒的原因常为食品食前保存温度不当，放置时间较长或食品加热不当

● 美国 炒米饭
● 欧洲 甜点、肉饼、色拉、奶和肉制品
● 中国 米饭、淀粉类制品

二、蜡样芽孢杆菌的生物学特性

兼性好氧。生长温度范围20～45℃菌落较大，干燥，灰白色，不透明，圆形，凸起，表面粗糙似磨砂玻璃或融蜡状，中等扩散。

10℃以下生长缓慢或不生长。50℃时不生长。   

在100℃下加热20min可破坏这类菌。

三、蜡样芽孢杆菌的检验方法

▶ 蜡样芽孢平板计数法检验程序流程

01) 样品的处理

◆ 称取25 g样品至盛有225 mL磷酸缓冲液或0.85%生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min-10000 r/min均质1min-2min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2 min，制成1:10样品匀液。

02) 液体的稀释

◆ 用1 mL的无菌吸管或微量移液器吸收1：10样品匀液1 mL，加到盛有9 mL磷酸盐缓冲液或0.85%生理盐水的试管中，充分混匀，制成1：100的样品匀液。

◆ 按上一步操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，直至适宜稀释倍数

03) 样品的接种

◆ 选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），单个平行实验中分别吸取0.3 mL、 0.3 mL、 0.4 mL的样品匀液加入MYP琼脂平板，一个稀释梯度两个平行（共6个板），然后用无菌L棒均匀涂布于整个平板。

04) 分离培养

在通常情况下，涂布之后将平皿静置10-30min，待样品匀液吸收后翻转平板，30℃ ± 1℃培养24h。如果培养物的菌落特征不显著，则继续培养至48h。

从符合计数要求的毎个平板中至少挑取5个典型菌落（小于5个全选），划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。   

蜡样芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生长的典型菌落为直径2 mm-5 mm，菌落表面粗糙，在深红色背景下呈现粉红色或微粉红色，环绕产生5 mm，宽的卵磷脂酶沉淀环。没有根状生长特性（蕈状芽孢杆菌形成根状生长特征）。

酚红为pH指示剂；发酵D—甘露醇产酸使菌落显黄色；卵黄含有卵磷脂，蜡样芽孢杆菌产生卵磷脂酶，在菌落周围产生沉淀环；多粘菌素B可抑制杂菌的生长。

MYP琼脂平板划线接种蜡样芽孢杆菌	MYP琼脂平板涂布接种蜡样芽孢杆菌
MYP琼脂平板接种蜡样芽孢杆菌：微粉红色（表示不利用甘露醇），周围有白色至淡粉色沉淀环（表示产卵磷脂酶）

蜡样芽孢显色培养基

蜡样芽孢杆菌在蜡样芽孢显色培养基平板上生长的典型菌落为直径2 mm-5 mm，菌落表面粗糙，中心蓝绿色，环绕产生5 mm，宽的卵磷脂酶沉淀环。

05) 生化鉴定

接种生化鉴定培养基后36±1℃培养18-24h结果

◆ 生化试验：溶菌酶耐性、甘露醇、葡萄糖（厌氧）、淀粉水解、硝酸盐还原、VP试验、明胶、动力、西蒙氏柠檬酸盐。 

革兰氏染色

◆ 从每个平板上挑取5个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，分别接种于营养琼脂斜面或平板，30℃ ± 1℃培养24 h,取培养物进行革兰氏染色和证实试验。

1、葡萄糖发酵试验

将培养物接种到糖发酵管中，置于厌氧培养箱中36℃ ± 1℃培养24 h，震荡后肉汤由红变黄，表明在厌氧条件下蜡样芽孢杆菌分解葡萄糖。（也可用液体石蜡形成厌氧环境）。

2、硝酸盐还原实验

将培养物接种到硝酸盐肉汤中，36℃ ± 1℃培养24 h后，加0.25 mL亚硝酸盐试剂A和0.25 mL亚硝酸盐试剂 B，在10 min内变为红色为阳性反应。

3、V-P实验

将培养物接种到改良V-P培养基中，36℃ ± 1℃培养48h或72h后，2ml培养基中添加1mL 5% α-萘酚乙醇溶液，后加入0.4 mL 40% KOH溶液，静置15min出现伊红粉红色为阳性。（注意1：必须在有氧的情况下反应，所以必须充分震摇。2：试剂顺序不能颠倒，可能产生假阳性）

4、酪蛋白分解实验

将培养物接种到酪蛋白琼脂培养基上，36℃ ± 1℃培养48 h，在靠近菌生长的地方培养基为透明的，则表明酪氨酸倍分解，阴性则继续培养至72 h，结果仍为阴性的弃去。

酪蛋白分解试验	溶血试验
酪蛋白琼脂平板	血平板
划线接种蜡样芽孢杆菌：菌落周围培养基出现澄清透明区（表示产生酪蛋白酶）	划线接种蜡样芽孢杆菌：浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有完全溶血环

5、溶菌酶实验

将培养物接种到0.001%溶菌酶营养肉汤中，另取培养物接种到普通营养肉汤中作对照，36℃ ± 1℃培养24 h，蜡样芽孢杆菌在本培养基中生长，为阳性反应。如出现阴性反应继续培养24 h,结果仍为阴性弃去。

6、触酶试验

在洁净的平皿内滴加3%过氧化氢溶液2滴，用牙签或一次性接种环挑取新鲜培养物放在平皿内过氧化氢溶液中，如果半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。

7、根状实验

挑取单个可疑菌落划平行直线于经室温干燥1d～2d的营养琼脂平板上，30 ℃±1 ℃培养24 h～48h，不能超过72h。用蜡样芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌标准株作为对照进行同步试验。蕈状芽胞杆菌呈根状生长的特征。蜡样芽胞杆菌呈粗糙山谷状生长的特征。

8、动力试验

用接种针挑取培养物穿刺接种于半固体培养基中，30℃ ± 1℃培养24 h。有动力的蜡样芽孢杆菌沿穿刺线呈扩散生长，而蕈状芽孢杆菌常呈绒毛状生长。

9、溶血试验

将疑似菌点种胰酪胨大豆羊血琼脂平板TSSB，30℃ ± 1℃培养24 h。有动力的蜡样芽孢杆菌会观察到的β-溶血反应。苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱的溶血现象，而炭疽芽孢杆菌通常为不溶血。

10、蛋白质毒素结晶试验

06) 计数方法

选择有典型蜡样芽胞杆菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20 CFU～200CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果出现a）~f）现象按公式（1）计算，如果出现g）现象则按公式（2）计算；

a）只有一个稀释度的平板菌落数在20 CFU～200 CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；

b）2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU～200 CFU之间，但只有一个稀释度的平板有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；

c）所有稀释度的平板菌落数均小于20 CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；

d）某一稀释度的平板菌落数大于200 CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；

e）所有稀释度的平板菌落数均大于200 CFU且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；

f）所有稀释度的平板菌落数均不在20 CFU～200 CFU之间且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU或大于200CFU时，应计数最接近20 CFU或200 CFU的稀释度平板上的典型菌落；

g）2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU～200 CFU之间且均有典型菌落。

公式一：

T----样品中金黄色葡萄球菌菌落数； A---某一稀释度典型菌落的总数； B---某一稀释度鉴定为阳性的菌落数； C---某一稀释度用于鉴定试验的菌落数； d---稀释因子。

公式二：

T --- 样品中蜡样芽孢杆菌菌落数; A1 --- 第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数; B1 --- 第一稀释度(低稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数; C1 --- 第一稀释度(低稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数; A2 --- 第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数; B2 --- 第二稀释度(高稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数; C2 --- 第二稀释度(高稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数; 1.1 --- 计算系数; d   --- 稀释因子(第一稀释度)。

07) 结果与报告

根据MYP平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数，按4.4中公式（1）、公式（2）计算，报告每g（mL）样品中蜡样芽胞杆菌菌数，以CFU/g（mL）表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

必要时报告蜡样芽胞杆菌生化分型结果。

08) 计算范例