微生物的生理生化实验—IMViC试验
发布时间：2024-12-30 浏览次数：11
在微生物学中，微生物的生理生化反应的结果有两种，第一，有机分子分解后形成了新的物质，第二，新的物质将不同微生物联系在一起，或利用或抑制，也就是他们间的物质基础。
一、生理生化反应的基础
为什么不同的微生物对营养物质的代谢能力不同呢？比如人类吃了秸秆，不好消化，牛就可以，为什么？……
这些都基于不同生物体内不同的酶系统，不同的酶系统对不同营养物质的分解能力不同，导致代谢产物也不一致，所以，微生物的生理生化反应也被作为细菌鉴定和分类的主要内容之一。
二、常见生理生化试验详细操作步骤
常见的生理生化试验主要有四个，主要用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，常合称为IMViC试验。
IMViC是吲哚试验（indol test）、甲基红试验（methyl red test，MR试验）、伏-波试验（Vogen-Prokauer test，V-P试验）和柠檬酸盐利用试验（citrate test）4个实验的缩写，其中，i是在英文中为了发音方便而加上去的。
(一) 单糖发酵试验
1. 实验目的：根据细菌生理生化的差异，了解细菌碳、氮源代谢类型的多样性，掌握部分根据生理生化反应进行细菌鉴定方法。简单说，就是考察微生物对不同单糖的消耗情况，选择合适的单糖。
2. 实验原理：在培养基中加入一定量的溴甲酚紫指示剂和杜氏小管，不同的单糖分解后产生不同的产物，产物的不同会导致指示剂颜色发生相应的变化。可以根据指示剂颜色的变化和小导管内是否产气，简单区分不能微生物。
3. 详细操作步骤
(1) 配制培养基：配制蛋白胨培养基，分装到相同的试管中，并加入杜氏小管。
(2) 添加单糖：将葡萄糖、乳糖等分别加入到蛋白胨培养基内，使其终浓度为10g/L。
(3) 接种：将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌按照液体接种方法分别接种于上述培养基管中，标记。
(4) 培养：放置于37℃培养箱中培养18-24h。
(5) 观察结果：由于一些细菌能分解某种糖类产酸，所以培养基中pH下降至7.0以下，在溴甲酚紫指示剂的显示下，培养基颜色由紫色变黄色。产酸者以“+”表示；如果同时产生气体，则培养基中倒置的小管内有气泡出现，此乃产酸又产气，以“⊕”表示；不分解，则指示剂不变色，用“-”表示。
(二) 吲哚试验
1. 实验目的：吲哚实验是一种常见的生理生化实验，通常用于检查某种有机物质中是否存在芳香族化合物。
2. 实验原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水培养基中的色氨酸，产生吲哚（靛基质），再与吲哚试验（对二甲基氨基苯甲醛）反应，形成红色化合物玫瑰吲哚，即为阳性反应。
3. 实验详细操作步骤
(1) 配制培养基：配制蛋白胨培养基，分装到相同的试管中，并加入杜氏小管。参照“杜氏小管产气”试验相关内容。
(2) 接种：将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌按照液体接种方法分别接种于上述培养基试管管中，标记。
(3) 培养：放置于37℃培养箱培养18-24h后，在两支试管中分别滴加10-20滴乙醚，震荡数次后静置3min。
(4) 添加吲哚试剂：每管沿管壁缓缓加入3-5滴吲哚试剂于培养液面上，待1-2min后观察。
(5) 结果显示：在交界面出现玫瑰红色环即为吲哚试验阳性（+），无红色环即为阴性（-）。
(三) 甲基红试验
1. 实验目的：用于检测和鉴别肠道细菌的发酵能力，特别是大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。
2. 实验原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，继而分解为甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH降至4.2以下，加入甲基红指示剂呈红色，此为阳性反应（+）；若产酸量少或产生的酸进一步转化为醇、醛、气体和水等，则培养基的pH仍为6.2以上，加入甲基红指示剂呈黄色，此为阴性反应（-）。
3. 详细操作步骤
(1) 分别将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌接种于两支葡萄糖蛋白胨水培养基中。
(2) 放置于37℃培养箱培养18-24h，取出，分别滴加2-3滴甲基红试剂，混匀，观察结果。
(3) 结果显示：
(四) 伏-波试验
1.实验目的：主要用于鉴别某些能发酵葡萄糖产生丙酮酸的细菌，特别是那些能够产生大量丙酮酸的细菌。
2. 实验原理：有些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进行缩合，脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中被氧化为二乙酰，再与培养基内精氨酸的胍基结合，生成红色化合物，则为伏-波试验阳性（+）。
3. 详细实验步骤
(1) 分别将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌接种于两支葡萄糖蛋白胨水培养基中。
(2) 放置于37℃培养箱培养18-24h，取出试管后倒掉一半培养液，然后分别加入氢氧化钾水溶液5-10滴和等体积的α-奈酚乙醇溶液，摇匀，37℃水浴锅水浴15-30min。
(3) 观察结果：培养液变为红色为阳性（+），黄色为阴性（-）。
(五) 柠檬酸盐利用实验
1.实验目的：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
2. 实验原理：柠檬酸盐为唯一碳源，磷酸铵为唯一氮源，细菌分解培养基中的柠檬酸盐、磷酸铵后产生碱性化合物，使培养基pH升高。因此，可根据能否利用柠檬酸盐来鉴别细菌。如细菌可利用柠檬酸盐作为碳源，细菌生长繁殖形成菌苔，分解柠檬酸盐生成碱性碳酸盐，使培养基pH上升到7.0以上，麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色，为柠檬酸盐利用试验阳性(+)；如细菌不能分解柠檬酸盐，则培养基颜色不发生变化，为柠檬酸盐利用试验阴性(-)。
3. 详细实验步骤
(1) 配制培养基：
(2) 接种：分别将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌接种于两支柠檬酸盐斜面培养基中。
(3) 培养：放置于37℃培养箱，培养18-24h后，观察结果。
(4) 预期结果:
大肠杆菌：-（无菌苔生长，培养基不变色）。
枯草芽孢杆菌：+（有菌苔生长，培养基变色）。
(六) 淀粉利用实验
1. 实验目的：主要用于鉴别微生物对淀粉的利用能力。
2. 实验原理：微生物对大分子物质如淀粉不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解，才能被微生物吸收利用。有些细菌有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶，淀粉酶可水解淀粉为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。
3. 实验步骤
(1) 配制淀粉培养基：
(2) 接种：分别接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌至淀粉固体培养基上，标记，注意接种长度尽量相等。
(3) 培养：放置于37℃培养箱培养18-24h后观察细菌的生长情况，
(4) 添加碘液：滴入少量鲁氏碘液，轻轻旋转平板使碘液均匀铺满整个平板。
(5) 观察结果：如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解，为阳性（+）；透明圈的大小反应细菌水解淀粉能力的强弱。
4. 预期结果：大肠杆菌：-，枯草芽孢杆菌：+。
三、注意事项
1. 该实验内容中所涉及菌种是作为生理生化反应的对比菌种，重点注意避免发生交叉污染和标记错乱的现象。
2. 使用酒精灯时需要特别注意操作安全。
3. 70%乙醇、乙醚等化学试剂可以燃烧，需要远离明火。
4. 单糖发酵试验部分，在接种后需要注意请缓摇动试管时避免气泡进入倒置小管中。
5. 吲哚试验部分，乙醚萃取过程一定要充分和静置，再沿管壁滴加吲哚试剂以避免破坏已分层界面。
文章来源：环凯（官网：huankai.com）转载于“ 微生物知识库 ”公众号；原作者~发酵菌人。
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