微生物检验方法验证操作中的关键问题解析
发布时间：2025-01-13 浏览次数：98
来源：环凯转载于“ 六扇门Study”公众号，作者~SIXDoors
伴随GB4789.45的发布和实施，食品实验室在采用非标方法检测时越来越重视方法的验证。不管参照GB4789.45 还是ISO16140-2，还是AOAC通则，验证过程的关键操作环节是必须要清楚的，例如：怎么模拟自然样本？定性检测检出限部分检出的要求？检出限和灵敏度的区别？
带着这些问题，小六翻阅了相关国际标准及GB4789.45的实施指南，抓取重点，分享给大家。
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定性方法验证中的灵敏度/检出限验证，污染水平要求部分检出？但具体多少算部分？加标部分检出的浓度要求呢？
不仅在GB 4789.45中有要求，ISO16140-2和AOAC通则中也都有部分检出水平的要求，理想情况下部分检出的概率最好是50%，但很难达到，所以对于检出的概率可以放大到25%~75%，部分检出时目标菌的浓度一般是在1CFU以下。
AOAC中提到：食品和饮料部分检出概率浓度一般在0.2-2CFU/样，检测概率1.00水平目标浓度在5CFU/样。环境表面部分检出概率一般10^4-10^6CFU/表面积。
ISO 16140-2中提到的部分检出浓度为0.7CFU。
但这些数据也仅仅只能供我们参考，因为检出水平还受样品基质，菌群类别特性等多方面因素的影响。
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GB4789.45 对人工污染要求“稀释液添加到样品中，不能影响样品状态”，如何操作？有相关标准可以参考吗？
在我们验证过程中，使用人工污染样的概率是很大的，许多实验室操作人工污染时添加稀释液的比例是比较高的，这对验证结果是有影响的。因为添加菌液过多是会影响到样品本身的特性，例如水分，这样样品在平衡处理过程中就会受到影响。
那么到底多少的比例可以认为是不会影响样品的状态呢？
按照ISO 16140-2中的要求，建议是不超过1%的比例。例如，需要污染的样品质量是25g,我们染菌的菌液量就不能超过0.25mL。很多实验室为了方便都添加1mL，这个量其实就有点高了。对于粉末类样品如果要添加菌粉，添加菌粉的量同样也是按照不超过1%的比例来操作。
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人工污染样本制备要考虑微生物受损状态下的验证
1.生鲜和冷加工食品接种未处理的微生物；
2.食品一般接种热损伤后微生物（如50℃ ，加热10min）要求获得50%-80%损伤；
3.干燥食品接种冻干培养物。
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充分验证很重要，大家拿到一份报告怎么看呢？关键看哪些点？
一看包容性和排他性
对于有选择性的项目，如大肠、金葡、沙门等，至少要看有没有做30株目标菌，30株非目标菌。
二看食品样品测试数量（准确度-定量，灵敏度-定性）
如果声称适用于食品大类，至少包括5个食品大类，每个大类6个样品（涵盖3个污染水平），每个样品一般5个重复，算起来150个样品测试，两个方法就是300个测试。
三看相对检出限验证（仅定性）
至少3个污染水平，每个接种20个样品进行测试，总共60个测试。
建议4个污染水平，如：阴性（0CFU/25g）、低浓度（0.1~1 CFU/25g)、中浓度（1~10 CFU/25g）、高浓度（10~100 CFU/25g），以上仅供参考，污染水平也跟食品的限量有关。
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疑问点：关于定性方法的灵敏度和检出限叫法的解释
灵敏度体现方法对于样品中极低污染水平(部分检出水平)的目标微生物的检出能力，较高污染水平的样品对于定性方法的验证并无太大意义。GB4789.45标准用检出限来表示定性方法的灵敏度。
小六看到在ISO16140-2中的灵敏度(sensitivity)研究的意思与GB4789.45中不一样，我们具体来看看！ISO16140-2中的灵敏度研究的目的是确定参考方法和替代方法之间的灵敏度差异。灵敏度研究采用自然污染样品和(或)人工污染的样品。需对不同的类别(categories)和类型(types)的样品进行测试，用接受限进行评价。接受限(最大可接受的差异)取决于该灵敏度研究属于配对研究或非配研究和测试类别的数量。
这个疑问，小六在GB4789.45-2023《食品安全国家标准 微生物检验方法验证通则》实时指南中找到了答案：国际上微生物检验方法验证中的灵敏度通常指部分检出水平样品的阳性符合率。食品安全国家标准微生物检验方法没有参考方法，可以计算阳性率，但是没有参考的阳性率，无法计算阳性符合率，因此食品安全国家标准微生物检验方法无法采用国际上通常使用的灵敏度。
