工程院食品安全院士团队

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检验流程及注意事项

▶ 1、样品制备

◆ 固体和半固体样品：称取25g样品，加入225mL无菌稀释液（灭菌蒸馏水或生理盐水或磷酸缓冲液），充分振摇，或用拍击式均质器拍打1 min 到2 min，制成1：10的样品匀液。

◆ 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至225mL无菌稀释液（灭菌蒸馏水或生理盐水或磷酸缓冲液）的适宜容器内（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或无菌均质袋中），充分振摇，或用拍击式均质器拍打1 min 到2 min，制成1：10的样品匀液。

◆ 取1mL 1:10稀释液注入含有9mL无菌水的试管中, 另换一支1mL无菌吸管反复吹吸，或在螺旋混合器上混匀，此液为1:100稀释液。   

▶ 2、接种及培养

◆ 根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照（用于监测培养基、稀释液、平皿、吸管及操作环境保证实验的有效性）。

◆ 及时将 20mL～25mL（用量增加，防止水分过度蒸发影响生长率）冷却至46℃的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红琼脂倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。至水平台面待培养基完全凝固。

◆ 倾注凝固后，正置平板，28℃±1℃，观察并记录培养至第5d的结果。   

关于正置培养的讨论

1、为水分蒸发导致盖子内面产生水珠，影响观察，同时平板边缘开裂

2、孢子飘散导致计数不准

3、孢子污染培养箱   

实际上在28℃下，平板的水分并不会蒸发的十分强烈，而且平板内部冷凝水产生一般是由于较大的温度波动，此时需要考虑的是培养箱放置房间的温度控制及培养箱的密封性。平板的开裂有两个因素，一个是失水过多，第二个是因为平板材料与培养基比热相差较大（玻璃平皿较容易出现），热胀冷缩导致的琼脂块与平板分离。关于玻璃平皿还有其他的一些问题：因生产厂家的不同及不同厂家的品种参次不齐，玻璃平皿盖底不和，缝隙较大，风机的空气压力易导致皿内真菌孢子的脱落，及培养箱污染。因此建议用一次性平皿，同时对培养间的温度控制，挑选购买培养箱的时候注意其密封性。

▶ 3、培养基的使用（两种任选一种）

PDA平板	孟加拉红平板

◆ 两种培养基都含有氯霉素，可以抑制细菌的生长；

◆ 对氯霉素耐药的一些细菌在这两种培养基上也生长，可以通过菌落形态来区分，或者通过染色镜检来判定；

◆ 如果需要分开报告霉菌和酵母菌的数量，主要通过菌落形态来区分。 

细菌、酵母菌及霉菌的不同菌落形态 

◆ 细菌：由于细胞小，形成的菌落较小，较薄、较透明、且有“细腻感”。可产生不同色素，菌落可呈现五颜六色且形态多样。

◆ 酵母菌：由于细胞较大且不能运动，一般菌落比细菌大、厚且透明度差。产生色素较单一，通常乳白色，少数为橙红色，个别黑色。

◆ 霉菌：菌落形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现蛛网状、绒毛状、棉絮状或毡状；菌落与培养基间的联系紧密，不易挑起，菌落正面与反面、边缘与中心的颜色和构造常不一致。 

细菌、酵母菌及霉菌在电镜及显微镜下的形态 

霉菌：细胞构造与酵母菌相似，但外观以菌丝体形式存在。

酵母菌：细胞通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状和香肠状。

▶ 4、计数

◆ 计算统一稀释度的两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应的稀释倍数。

◆ 若有两个稀释度平板上菌落数均在10-150CFU，则按照 GB4789.2 的相应规定进行计数。

◆ 若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。   

◆ 若所有平板上菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 

◆ 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。 

◆ 若所有稀释度平板的菌落数均不在10-150CFU之间，其中一部分小于10CFU或大于150CFU,则以最接近10或150CFU的平均菌落数乘以稀释倍数做计算。 

▶ 5、结果报告

◆ 菌落数按“四舍五入”原则修约。菌落数在10以内时，采用一位有效数字报告；菌落数在10-100之间时，采用两位有效数字报告。

◆ 菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。

◆ 若空白对照平板上有菌落出现，则此次检测结果无效。   

◆ 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。

过程中所用到的培养基项 

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