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GB4789.15-2016霉菌和酵母计数检验及注意事项

发布时间:2025-02-08      浏览次数:383    分享:

检验流程及注意事项

GB4789.15-2016霉菌和酵母计数检验及注意事项

▶ 1、样品制备

◆ 固体和半固体样品:称取25g样品,加入225mL无菌稀释液(灭菌蒸馏水或生理盐水或磷酸缓冲液),充分振摇,或用拍击式均质器拍打1 min 到2 min,制成1:10的样品匀液。

◆ 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品至225mL无菌稀释液(灭菌蒸馏水或生理盐水或磷酸缓冲液)的适宜容器内(可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或无菌均质袋中),充分振摇,或用拍击式均质器拍打1 min 到2 min,制成1:10的样品匀液。

取1mL 1:10稀释液注入含有9mL无菌水的试管中, 另换一支1mL无菌吸管反复吹吸,或在螺旋混合器上混匀,此液为1:100稀释液。   

▶ 2、接种及培养

根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照(用于监测培养基、稀释液、平皿、吸管及操作环境保证实验的有效性)。

及时将 20mL~25mL(用量增加,防止水分过度蒸发影响生长率)冷却至46℃的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红琼脂倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。至水平台面待培养基完全凝固。

倾注凝固后,正置平板,28℃±1℃,观察并记录培养至第5d的结果。   

关于正置培养的讨论

1、为水分蒸发导致盖子内面产生水珠,影响观察,同时平板边缘开裂

2、孢子飘散导致计数不准

3、孢子污染培养箱   

实际上在28℃下,平板的水分并不会蒸发的十分强烈,而且平板内部冷凝水产生一般是由于较大的温度波动,此时需要考虑的是培养箱放置房间的温度控制及培养箱的密封性。平板的开裂有两个因素,一个是失水过多,第二个是因为平板材料与培养基比热相差较大(玻璃平皿较容易出现),热胀冷缩导致的琼脂块与平板分离。关于玻璃平皿还有其他的一些问题:因生产厂家的不同及不同厂家的品种参次不齐,玻璃平皿盖底不和,缝隙较大,风机的空气压力易导致皿内真菌孢子的脱落,及培养箱污染。因此建议用一次性平皿,同时对培养间的温度控制,挑选购买培养箱的时候注意其密封性。

▶ 3、培养基的使用(两种任选一种)

PDA平板 孟加拉红平板 
PDA平板孟加拉红平板

两种培养基都含有氯霉素,可以抑制细菌的生长;

对氯霉素耐药的一些细菌在这两种培养基上也生长,可以通过菌落形态来区分,或者通过染色镜检来判定;

如果需要分开报告霉菌和酵母菌的数量,主要通过菌落形态来区分。 

细菌、酵母菌及霉菌的不同菌落形态 

◆ 细菌:由于细胞小,形成的菌落较小,较薄、较透明、且有“细腻感”。可产生不同色素,菌落可呈现五颜六色且形态多样。

◆ 酵母菌:由于细胞较大且不能运动,一般菌落比细菌大、厚且透明度差。产生色素较单一,通常乳白色,少数为橙红色,个别黑色。

◆ 霉菌:菌落形态较大,质地疏松,外观干燥,不透明,呈现蛛网状、绒毛状、棉絮状或毡状;菌落与培养基间的联系紧密,不易挑起,菌落正面与反面、边缘与中心的颜色和构造常不一致。 

细菌、酵母菌及霉菌在电镜及显微镜下的形态 

霉菌:细胞构造与酵母菌相似,但外观以菌丝体形式存在。

霉菌:细胞构造与酵母菌相似,但外观以菌丝体形式存在

酵母菌:细胞通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状和香肠状。

酵母菌:细胞通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状和香肠状。

▶ 4、计数

计算统一稀释度的两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应的稀释倍数。

若有两个稀释度平板上菌落数均在10-150CFU,则按照 GB4789.2 的相应规定进行计数

若所有平板上菌落数均大于150CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。   

若所有平板上菌落数均小于10CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 

若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。 

◆ 若所有稀释度平板的菌落数均不在10-150CFU之间,其中一部分小于10CFU或大于150CFU,则以最接近10或150CFU的平均菌落数乘以稀释倍数做计算。 

▶ 5、结果报告

菌落数按“四舍五入”原则修约。菌落数在10以内时,采用一位有效数字报告;菌落数在10-100之间时,采用两位有效数字报告。

菌落数大于或等于100时,前3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数来表示结果;也可用10的指数形式来表示,此时也按“四舍五入”原则修约,采用两位有效数字。

若空白对照平板上有菌落出现,则此次检测结果无效。   

称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告,报告或分别报告霉菌和/或酵母数。

过程中所用到的培养基项 

货号名称规格
21050马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)250g/瓶
CP0010马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)平板90mm×20个
21010孟加拉红培养基(虎红琼脂)250g/瓶
021010B孟加拉红 (虎红)琼脂平板90mm×20个
021010P1孟加拉红培养基(虎红琼脂)250g/瓶

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GB4789.15霉菌和酵母计数检验